第 18 号
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動物実験施設における遺伝子導入動物の
取り扱いに関する手引き(その1)
国立大学動物実験施設協議会 平成7年5月
  1. はじめに
     近年,遺伝子を導入または改変した,いわゆる遺伝子導入動物(以下,Tg動物と略)が生産され,広く使用されるようになってきた。また,国内外で作製されたTg動物の研究者間の分与や業者による販売も開始され,今後Tg動物を用いた動物実験が益々多く行われるようになると予想される。
     現在,Tg動物を取り扱う動物実験は,「組換えDNA実験に準ずる実験(動物個体を用いる実験:附属資料1)」として扱われ,その基本的事項は,「大学等、における組換えDNA実験指針(平成6年6月)」に示されている。また動物実験であるからには,動物実験施設職員及び実験者は「動物の保護及び管理に関する法律」「実験動物の飼養及び保管等に関する基準」「大学等における動物実験について(昭和62年5月25日付け学術国際局長通知)」や,各大学等における「動物実験指針」などを遵守するという前提がある。
     この手引きは上記の指針,法律等のもとで,各動物実験施設内で行われるTg動物を用いた実験において,その取扱いに関する基本的事項について記載してある。
     なお,Tg動物の作出にはその前段階として組換えDNA実験が伴うものであり,これに関する諸事項も「大学等における組換えDNA実験指針」に示されていることから,本手引きには含めない。また,Tg動物のうち文部大臣により安定かつ安全な系統動物として認定されたものは,一般の実験動物の系統と同様に取扱えることから本手引きには含めない。

  2. Tg動物の概念
     ここでいうTg動物とは,遣伝子操作によって遺伝子を導入または改変した動物をいう。いわゆるtransgenic animalやgene targeted animalである。一般にマウスが最もよく用いられることから,本手引きはマウスを中心とした小型げっ歯類を対象とした。
     なお,遺伝子組込みベクターを導入した遺伝子治療モデル動物や,異種の遺伝子を組込んだ組織等の移植実験動物もTg動物に準ずるものとして取扱うこととする。

  3. Tg動物取扱いの基本
     組換えDNA実験では,各種DNAの組換え分子を試験管内で作製し,それを微生物等の細胞に移入し,DNAを増殖させたり,移入細胞(組換え体)を用いて実験を行う。この場合,組換えDNAや組換え体が実験者や外部環境へ伝播・拡散することを防止する方策として実験の安全確保が定められている。すなわち物理的封じ込め(Pレベル)と生物学的封じ込め(Bレベル)である。
     一方,動物個体を用いる実験は,宿主である動物の態様が微生物や動植物培養細胞とは全く異なることから,組換えDNA実験から切り離されて,「組換えDNA実験に準ずる実験」として取扱われているのは前述の通りである。すなわち,Tg動物はそれ自体が組換え体と考えられ,組換えDNA実験の組換え体が肉眼で確認されないのに対し,動物個体ごとに肉眼で観察可能であり,管理区域内での存否をただちに確認できる。また,Tg動物はこれまで自然界に存在しない動物であり,これが外部へ逃亡した場合は自然環境に影響を与える可能性がある。すなわち,同種の動物との交配・繁殖することにより,自然生態系を変化させることも考えられる。したがってTg動物の取扱いの基本は実験室外へ逃亡させない措置が絶対必要条件である。
     次にTg動物は,作出の時点で上記のようにこれまで存在しなかった新しい系統が得られたことになる。したがって各研究者が作出したTg動物は他のどこにもない系統である。この系統を維持するためには厳密な感染症対策が必要となるので微生物的モニタリングが不可欠である。導入遺伝子の安定性や,Tg動物の遺伝的素因にもとづく系統維持の困難さ,及びTg動物の遺伝子的モニタリングの必要性等は研究自体の問題であるため,ここでは取りあげない。
     Tg動物の取扱いをまとめると次のようになる。
    (1)Tg動物がケージ外や飼育室外へ逃亡できないように管理する。
    (2)Tg動物の維持に際しては,微生物感染症対策を厳密に行う。
     以上の2点を考慮した措置を講ずれば,Tg動物は他の実験動物と同様に取り扱って差し支えない。

  4. Tg動物の作出
    1. 動物
       Transgenic animal作出の場合は受精卵に,gene targeted animal作出の場合は胚幹(ES)細胞に遺伝子を導入し,前者は直接母体に,後者は胚盤胞に注入してから母体にそれぞれ移植する。
       施設内でTg動物を作出するために使用する動物は,将来他施設へ分与する可能性を考慮してSPF動物が望ましい。また,その後交配により子孫を得,系統確立までに使用する動物もSPF動物が望ましい。一般に施設での小型げっ歯類を用いる動物実験ではSPF動物を用いることが多く,ブリーダーの選択,遺伝的・微生物的モニタリング(ブリーダーからの証明を含む),購入・授受の方式,検疫等についての研究者側,施設側の対応は一般動物と変わらない。しかしTg動物は他実験動物と異なり,将来は一系統として繁殖維持し続けることが多いので,微生物感染症対策が重要である。昨今国内外で特に問題となっているのは,マウス肝炎ウイルス(MHV),センダイウイルス(HVJ),マイコプラズマ感染であり,このほか持続感染を起こす微生物についても考慮する。したがってこれらの微生物に関する検査体制を整備する必要があろう。
       研究者によってはコンベンショナル動物(及び環境)を用いる場合があるが,この場合はSPF動物から隔離した実験室を設定し,これについても微生物モニタリングを行う必要がある。
    2. 作出のための実験・飼育室
       Tg動物作出用には,もとになる動物の系統,生殖能力,組換えDNAの種類,実験者の習熟度などで,必要な動物数の幅が大きく,統一したスペースを提示する事は困難である。一般的には,組換えDNA作製は施設外で行われるであろうから,それに要するスペースは考える必要はない。実験室は原則的に3室必要である。
      1受精卵,胚操作用の実験室:実験室は「大学等における組換えDNA実験指針」に定められた安全度を有するものとする。
      2非Tg動物飼育室:受精卵や胚を供給する動物,偽妊娠動物作製用等
      3Tg動物作出用飼育室:飼育室は「大学等における組換えDNA実験指針」に定められた安全度を有するものとする。
       必要な動物数は幅が大きいが,Tg動物を1系統作出するとした場合の動物数及びケージ数を参考例として第1表に示す。なお,ここ数年発生工学分野の技術的進展が著しく,凍結受精卵を使用した組換えDNA実験が可能である。このため,第1表の非Tg動物用動物数やケージ数を減ずることは可能である。

      第1表 1系統あたりの必要動物数及びケージ数(参考例)
      動物
      匹数
      ケージ数
      非Tg動物
      〜100
      〜50
      Tg動物
      200〜250
      50〜100

    3. Tg動物の維持
       実験初心者並びに施設が最も注意しなければならないのは,新しいTg動物の系統が確立されると,その繁殖・維持のためのスペースが必要となることである。F2以後のTg動物系統の繁殖・維持数,すなわちスペースと労力をどの程度見込むかが極めて重要である。これは実験の規模によって異なるが,飼育Tg動物数は指数関数的に増加し,数百匹から千匹のオーダーとなるのでこの点をあらかじめ想定しておかなければならない。それだけのスペース,飼育棚,ケージ数が必要となることを実験開始時に実験者並びに施設側は覚悟しておくべきである。なお,Tg動物は受精卵や精子を凍結して系統保存を図ることも可能である。

  5. Tg動物の飼育管理
    1. 飼育室・実験室
      1. Tg動物が逃亡または隠れるような床,壁,天井の隙間や,給排気口・排水管等の開口部には逃亡防止策を講ずること。例えば,給排気口には金属性の多孔板や網,排水口等の開口部にはスノコを設置し,その径は8mm以下が望ましい。
      2. 廊下と飼育室の間の扉(入口)には「ネズミ返し」をつけ,その高さは45cm以上が望ましい。できれば飼育室に前室を設けるか,飼育棚・実験台を設置するスペースと入口との間も「ネズミ返し」で区切り,ここを前室の代用とすることが望ましい。また適宜ネズミ取りを数個置いて,逃亡防止策を講ずる。
      3. 飼育室・実験室はTg動物専用とし,非Tg動物との同室飼育は原則として避ける。やむを得ない事情により同室飼育する場合は,それらの動物はTg動物扱いとする。また,飼育室・実験室にはそれを示す標識をつけ,関係者以外の立入制限区域とする。
    2. 飼育
      1. 飼育棚等の設備とケージ
         飼育室に多くの系統のTg動物を飼育する場合は,1系統の場合と異なりより厳重な管理が必要となる。飼育棚及びケージは逃亡防止に配慮した適切なものにする。
      2. 個体識別
         ケージはもとより,ケージ内のTg動物は個体識別を明瞭にし,個体数のチェックをケージ毎に定期的に行い,必ず記録し,実験終了時までは保管する。
      3. 飼育管理作業
         Tg動物飼育室内での飼育管理作業は,原則として「大学等における組換えDNA実験指針」に定める実験責任者及び実験従事者が行うことが望ましい。なお,施設の職員等,上記実験責任(従事)者以外の者が行う場合は,組換えDNA実験安全委員会または実験責任者との間で,あらかじめ充分協議を行うこと。
      4. 感染性因子
         感染性ウイルスを排出する可能性があるTg動物は,飼育・実験・維持等はすべて感染動物実験区域内で行う必要がある。この際の物理的封じ込めレベルは,異種のDNA分子,組換えDNA分子または組換え体を得るための作成実験または増殖実験におけるレベルと同等のレベルを採用する。なお感染実験そのものは,昭和62年に国立大学動物実験施設協議会において定められた「感染動物実験における安全対策(案):附属資料2」の基準に則して飼育管理を行う。
      5. Tg動物子孫の飼育管理
         実験に用いたTg動物の子孫を得てそれを飼育する場合は,第1代と同様の管理を行う。
      6. 排泄物・動物個体等の処理
         Tg動物の排泄物,残存飼料・飲用水等は必要に応じて消毒,滅菌,または焼却等の処理を行うこと。実験終了後の動物個体等は,安楽死後消毒または滅菌を必要に応じて行い,その後焼却処理を行うこと。また飼育ケージ等も必要に応じて,洗浄前に消毒・滅菌等の処理を行う。
      7. その他
         前述のごとく,飼育数が非常に増加するので,予めTg動物の受精卵凍結または精子凍結等により系統保存を図るべきである。